概述

KAPA NGS FFPE DNA QC 試劑盒在構(gòu)建 NGS 文庫之前提供可靠的基于 qPCR 的人類 FFPE DNA 樣本鑒定和推薦輸入評(píng)估。每個(gè)試劑盒都包含優(yōu)化的高性能 qPCR 主混合物、DNA QC 標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)混形式的引物。引物針對(duì)人類長散在核元件 (LINE)，提供更高的靈敏度并最大限度地減少 QC 所需的樣本量。

與 DNA QC 標(biāo)準(zhǔn)相比，樣本質(zhì)量通過對(duì)短擴(kuò)增子和長擴(kuò)增子的相對(duì)定量來評(píng)估。計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量分?jǐn)?shù) (Q 分?jǐn)?shù)) 用于計(jì)算所需的樣本輸入量，這為高質(zhì)量文庫制備提供了最大的可能性。使用該試劑盒生成的 Q 分?jǐn)?shù)可用于預(yù)測文庫制備的結(jié)果并優(yōu)化 FFPE DNA 樣本的文庫構(gòu)建參數(shù)。

KAPA FFPE DNA QC 試劑盒已在 KAPA HyperPETE 組織 DNA 工作流程中驗(yàn)證，但理論上可能與 KAPA HyperCap FFPET DNA 工作流程兼容。

KAPA NGS FFPE DNA QC 試劑盒的優(yōu)勢

·       最大限度地提高受損 FFPE DNA 樣本的成功率

·       在一次測定中以最少的投入評(píng)估質(zhì)量并推薦投入

·       通過靈活且易于自動(dòng)化的工作流程節(jié)省寶貴的時(shí)間

KAPA NGS FFPE DNA QC 試劑盒的原理

KAPA NGS FFPE QC 試劑盒通過比較 LightCycler ® qPCR 檢測中較大 (191-bp) 擴(kuò)增子和較小 (66 bp) 擴(kuò)增子的擴(kuò)增情況來評(píng)估樣本質(zhì)量，該檢測使用針對(duì)人類長散在核元件 (LINE) 的引物。針對(duì) LINE 元件可以從極少量的輸入 FFPET DNA 中產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)，從而獲得更靈敏的結(jié)果并很大程度地減少 QC 測試樣本的使用。這可以對(duì)質(zhì)量進(jìn)行可靠的評(píng)估，該質(zhì)量評(píng)估是整個(gè)基因組的平均質(zhì)量，而不是單拷貝的管家基因。此外，與分光光度法和電泳法相比，qPCR 檢測在評(píng)估樣本質(zhì)量方面具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。

比較這兩個(gè) qPCR 檢測的相對(duì)擴(kuò)增結(jié)果可得出樣本的 Q 值，該 Q 值可與已知數(shù)量的 QC PCR DNA 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，作為樣本質(zhì)量的指標(biāo)。然后可適當(dāng)調(diào)整低質(zhì)量樣本的輸入 DNA 量，以提高文庫制備成功的可能性。

最大限度地提高受損 FFPE DNA 樣本的成功率

質(zhì)量調(diào)整輸入（Q 輸入）顯著改善了 KAPA HyperPETE 組織 DNA 工作流程中低質(zhì)量 (LQ)、中等質(zhì)量 (MQ) 甚至高質(zhì)量 (HQ) FFPE DNA 樣本的測序覆蓋率指標(biāo)。

圖 1 . 使用 KAPA NGS FFPE DNA QC Kit 的質(zhì)量調(diào)整輸入，與未調(diào)整的 10 ng 輸入相比，KAPA HyperPETE Pan Cancer 和 Hot Spot Panels 的測序覆蓋率指標(biāo)顯著提高。低質(zhì)量 (LQ) FFPET DNA 樣本的標(biāo)準(zhǔn)化 Q 分?jǐn)?shù)范圍為 0.042 至 0.2。在 KAPA HyperPETE 組織 DNA 工作流程中，質(zhì)量調(diào)整（Q 調(diào)整）輸入范圍為 60 至 248 ng。

圖 2 . 質(zhì)量調(diào)整輸入（Q 輸入）顯著提高了 KAPA HyperPETE 組織 DNA 工作流程中 KAPA HyperPETE Pan Cancer Panel 覆蓋的面板外顯子的百分比，提高了 500 倍或更多。與 10 ng 的覆蓋率相比，低質(zhì)量樣本（LQ）顯示出明顯的改善。但是，中等質(zhì)量（MQ）甚至高質(zhì)量（HQ）樣本也可以通過使用 KAPA NGS FFPE DNA QC Kit 計(jì)算的 Q 輸入受益。